单细胞RNA测序（scRNA-seq）可通过转录谱分析发育、再生、衰老、以及疾病发生过程中的细胞和分子机制。然而，目前大多数的定量方法局限在基因水平，无法区分具有不同结构和功能的转录异构体的差异表达。
最近，我校中山眼科中心刘奕志和胡友金团队开发了一种低成本、高效的新型单细胞测序技术scRCAT-seq，并应用于分析人视网膜发育的细胞图谱，发现视网膜干细胞的分化及细胞命运决定过程中TSS和TES的变化规律。研究成果于2020年10月13日，在Nature Communications在线发表论文“Single-cell RNA cap and tail sequencing (scRCAT-seq) reveals subtype-specific isoforms differing in transcript demarcation”。
结合转录本首尾捕获和机器学习系统分析TSS和TES
在此研究中，scRCAT-seq通过对单细胞全长cDNA的5’及3’进行靶向捕获，基于常规的短读长测序平台进行测序（图1），结合随机森林（random forest, RF）等机器学习算法获得高准确性的TSS和TES（图2）。与已报道的测序方法进行比较，scRCAT-seq可显著提高所鉴定TSSs/TESs的准确性4-5倍。
图1：scRCAT-seq的实验流程示意图
图2：机器学习算法显著提高所鉴定TSSs/TESs的准确性
ScRCAT-seq具有低成本、高效率的特点
与已有的全长转录本测序方法Smart-seq2和ScISOr-seq相比，scRCAT-seq具有成本低，效率高等特点。以相同的成本，scRCAT-seq所能检测的转录本数量是ScISOr-seq的7倍（图3），scRCAT-seq能检测到大量ScISOr-seq所不能检测到的低表达的基因。
图3：scRCAT-seq具有高效率、低成本的特点
scRCAT-seq的可适性强
scRCAT-seq适用于分析不同物种来源、不同细胞类型和数量的样品，进行细胞分群，细胞类型特异的转录本鉴定，稳定性好，并可在不同物种和细胞中标注新的转录本，丰富现有标注RNA转录本的数据库。scRCAT-seq可与单细胞三代测序技术，或者sanger测序技术结合，对全长转录本的结构，特别是内在外显子进行进一步鉴定。
应用于分析人视网膜发育过程中转录组TSS和TES的动态变化
以人胚胎干细胞来源的视网膜类器官为研究对象，通过对10571个单细胞进行测序分析，该研究描绘了视网膜祖细胞（RPC）向光感受器前体细胞（PR precursors），进一步向视锥细胞（cone）分化的转录异构体的表达图谱，发现转录异构体变化最显著的时间点发生在RPC向光感受器前体细胞转变的节点。该研究还发现CCND1异构体可能通过调节细胞周期，介导RPC向光感受器前体细胞的命运转换（图4）。
图4：人类视锥细胞发育过程中RNA异构体的动态变化
